چکیده:

بیماری پارکینسون یک اختلال تخریب کننده نورونی شدید و پیش رونده سیستم عصبی مرکزی است که یکی از شایع ترین اختلالات حرکتی می­باشد. برای اکثر بیماری‌های تخریب کننده عصبی اقدامات موجود حکم مسکن را دارند. به علت اینکه شواهد متعددی پیشنهاد می­ کنندکه دربسیاری از بیماری‌های تخریب کننده نورونی مرگ سلولی غیر عادی رخ می­دهد، داروهایی که بتوانند مرگ سلولی را متوقف کنند ممکن است از تخریب نورونی بیشتر جلوگیری کرده و پیشرفت بیماری را آهسته کنند. ترکیبات عمده عصاره برگ زیتون فنول هایی مانند اولئوروپئین می­باشند، که آثار ضد آپوپتوزی از خود نشان می­ دهند بنابراین، مطالعه حاضر جهت بررسی اثر عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین بر سمیت سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین بر روی سلول‌های PC12  به عنوان مدل in vitro بیماری پارکینسون طراحی شد. جهت القاء سمیت سلولی، سلول‌های PC12 با 150 میکرومول 6-هیدروکسی دوپامین تیمار شدند. در گروه­های درمانی دوزهای متفاوت برگ زیتون(g/mlμ600-100) واولئوروپئین(g/mlμ25-5) جهت بررسی اثر احتمالی محافظت کننده آنهااستفاده شد. سمیت سلولی توسط تست MTT تعیین شد. میزان ROS داخل سلولی توسط پروب فلورسنس دی­کلرو فلورسین دی استات از طریق روش فلوریمتری ارزیابی شد. قطعات DNA وپارامترهای بیوشیمیایی آپوپتوز (Bax, Bcl2  و caspase3) به ترتیب توسط الکتروفورز در ژل آگارز و ایمونوبلاتینگ ارزیابی شدند. نتایج ما نشان دادند که افزایش 6-هیدروکسی دوپامین منجر به افزایش میزان آسیب سلولی، تولید  ROS داخل سلولی، فعال شدن کاسپاز3، قطعه­قطعه شدن DNA و همچنین افزایش نسبت Bax/Bcl2  می­گردد. تیمار با عصاره برگ زیتون(μg/ml 400و600) و اولئوروپئین ( μg/ml20و25)  اختلالات ذکر شده را کاهش می­دهد. روی هم رفته نتایج پیشنهاد می­ کنند که عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین در برابر آپوپتوز القاء شده در اثر 6-هیدروکسی دوپامین اثر محافظت کننده نورونی دارند. حداقل بخشی از این اثر محافظت کننده به واسطه کاهش آپوپتوز نورونی اعمال می­گردد و پیشنهاد کننده پتانسیل دارویی عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین برای کاهش تخریب عصبی سلول­های دوپامینرژیک می‌باشد.

کلمات کلیدی:عصاره برگ زیتون، 6-هیدروکسی دوپامین، آپوپتوز، سلول­هایPC12، اولئوروپئین.

فهرست مطالب:

 فصل اول… 1

1-1    معرفی بیماری  پارکینسون. 2

1-2    فاکتورهای دخیل در بیماری پارکینسون. 4

1-2-1  افزایش سن.. 4

1-2-2  فاکتور های محیطی.. 4

1-3    سیستم یوبی کوئیتین پروتئوزوم 16

1-3-1  فاکتورهای ژنتیکی دخیل دربیماری پارکینسون. 17

1-4    التهاب عصبی و بیماری پارکینسون. 21

1-4-1  نقش فعال شدن گلیال ها در بیماری پارکینسون. 22

1-4-2  تغییرات ریز محیط ها در بیماری پارکینسون. 23

1-5    معرفی گیاه زیتون. 23

1-5-1  خصوصیات شیمیایی عصاره برگ زیتون. 24

1-6    اولئوروپئین  به عنوان ترکیب اصلی برگ زیتون. 28

فصل دوم.. 30

2-1    مواد و روشها 31

2-1-1  وسایل مورد استفاده. 31

2-1-2  مواد و داروهای مورد استفاده. 31

2-1-3  بافرها و محلولهای مورد استفاده. 32

2-2    جمع آوری برگ زیتون. 34

2-3    تهیه عصاره برگ زیتون. 34

2-4    کشت سلول. 35

2-5    سنجش بقای سلولی. 35

2-5-1  MTT assay  35

2-6    سنجش ROS داخل سلولی. 37

2-6-1  گروه‌های مورد استفاده در تست ROS. 38

2-7    استخراج DNA از سلول‌های PC12 39

2-7-1  گروه‌های مورد آزمایش جهت استخراج DNA 40

2-8    الكتروفورز قطعات DNA.. 41

2-8-1  گروه‌های مورد آزمایش در وسترن بلات… 41

2-8-2  استخراج پروتئین از سلول‌های PC12 42

2-8-3  اندازه گیری کل پروتئین.. 43

2-8-4  بررسی میزان پروتئینهای درگیر در آپوپتوز (Bax, Bcl-2, Caspase 3) با بهره گرفتن از روش وسترن بلات    44

2-8-5  الکتروفورز پروتئینها روی ژل  SDS-PAGE.. 44

2-8-6  انتقال از ژل به کاغذ  PVDF. 45

2-8-7  بلاکینگ     46

2-8-8  مرحله شستشو. 46

2-8-9  اضافه کردن آنتی بادی اولیه. 47

2-8-10            اضافه کردن آنتی بادی ثانویه. 47

2-8-11            افزودن سوبسترا و ثبت باندهای نورانی روی فیلم رادیولوژی.. 47

2-8-12            ظهور فیلم.. 48

2-8-13            زدودن آنتی بادیهای متصل به آنتی ژن از روی کاغذ و کنترل لودینگ نمونه ها 48

2-8-14            آنالیز تصاویر گرفته شده از باندهای پروتئینی.. 49

2-9    آنالیز آماری. 49

فصل سوم.. 50

3-1    نتایج. 51

3-1-1  بررسی تأثیرات غلظتهای متفاوت 6-هیدروکسی دوپامین بر بقای سلول‌های PC12. 51

3-1-2  بررسی اثرات دوزهای متفاوت عصاره بر سلول‌های PC12 52

3-1-3  بررسی اثرات دوزهای متفاوت اولئوروپئین بر سلول‌های PC12 53

3-1-4  بررسی اثرات دوزهای متفاوت عصاره برگ زیتون(OLE) بر بقای سلول‌های  PC12کشت شده در حضور 6-هیدروکسی دوپامین.. 54

3-1-5  بررسی اثرات دوزهای متفاوت اولئوروپئین بر بقای سلول‌های  PC12کشت شده در حضور 6-هیدروکسی دوپامین   55

3-1-6  بررسی اثرات دوزهای موثر عصاره برگ زیتون بر میزان تولید ROS داخل سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین   56

3-1-7  بررسی اثرات دوزهای موثر اولئوروپئین بر میزان تولید ROS داخل سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین   57

3-1-8  آنالیز نتایج به دست آمده از وسترن بلات برای پروتئینهای درگیر در آپوپتوز سلولی.. 58

3-1-9  بررسی اثرات عصاره برگ زیتون واولئوروپئین بر قطعه قطعه شدن DNA ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین   63

فصل چهارم.. 64

4-1    بحث و نتیجه گیری. 65

4-2    بروز استرس اکسیدایتو وآپوپتوز در بیماری پارکینسون. 65

4-3    عملکرد کانال های کلسیم و بیماری پارکینسون. 72

4-4    بروز التهاب نورونی در بیماری پارکینسون. 73

4-5    نتیجه گیری کلی. 76

4-6    پیشنهادها 77

1-1      معرفی بیماری  پارکینسون:

بیمار ی پارکینسون یک اختلال تخریب کننده عصبی است که به عنوان دومین بیماری تخریب کننده عصبی رایج در بین افراد پس از بیماری آلزایمر می‌باشد . میزان شیوع این بیماری درافراد بالای 50 سال حدوداً 2 درصد است(1).

پارکینسونیسم یا پارکینسون ثانویه در اثر مسمومیت با منگنز، مسمومیت با مونوکسیدکربن، ضربه مزمن و مداوم به سر  و برخی مواد مخدر تزریقی ممکن است ایجاد گردد که علائمی مشابه با پارکینسون دارد. اولین گزارشات مربوط به پارکینسونیسم به 5000 سال قبل از میلاد در هندوستان بر می‌گردد تا اینکه در سال 1817 دکتر جیمز پارکینسون اولین گزارشات مربوط به بیماری پارکینسون را ارائه داد(2).

بیماری پارکینسون همراه با اختلالات حرکتی می‌باشد که می توان به سفتی عضلانی ، لرزش در حال استراحت، آکینزی یا مشکل در شروع حرکات، کاهش حرکات خود بخودی و برادی کینزی یا آهسته بودن حرکات، ضعف در حفظ تعادل، کاهش حرکات وابسته یعنی حرکات ناخود آگاه طبیعی بدن مانند تغییر حالات چهره به هنگام صحبت کردن اشاره کرد(3).

بیماری پارکینسون توسط از دست دادن 50 تا 70 درصد نورون های دوپامینرژیک بخش متراکم جسم سیاه مشخص می‌گردد. علاوه بر نورون های دو پامینرژیک سایر جمعیت های نورونی نیزکه شامل بخشهایی از لوکوس سرلئوس[1] (نورآدرنرژیک)، هسته های رافه[2] (سروتونرژیک)،هسته های ماینرت[3] و هسته حرکتی پشتی واگ[4] (کولینرژیک)، قشر سینگولیت[5]، قشر اینتورینال[6]، پیاز بویایی[7] و گانگلیون های سمپاتیک و پاراسمپاتیک در روده نیز متاثر می‌گردند. تخریب برخی از این نواحی غیر دوپامینرژیک با علائم ثانویه بیماری پارکینسون از قبیل اختلالات شناختی، غیر حرکتی، خواب واتونومیک مرتبط می‌باشند(4).

یکی از نظریه هایی که در مورد علت بیماری پارکینسون مطرح است این است که این بیماری ناشی از یک عدم تعادل بین تحریک و مهار در عقده های قاعده ای در اثر مهار دوپامینی پوتامن می‌باشد. در نتیجه، خروجی مهاری از پوتامن به قطعه خارجی گلوبوس پالیدوس افزایش یافته و منجر به کاهش خروجی مهاری از گلوبوس پالیدوس خارجی به هسته زیر تالاموسی می‌گردد که این امر به نوبه خود موجب افزایش خروجی تحریکی به قطعه داخلی گلوبوس پالیدوس از هسته زیر تالاموسی می‌گردد. افزایش تحریک گلوبوس پالیدوس داخلی باعث افزایش مهار تالاموس شده، در نتیجه خروجی تحریکی از تالاموس کاهش یافته  و در اثر کاهش تحریک قشر اختلالات کم حرکتی بروز می‌یابند(3).

علاوه  بر تخریب نورون های دو پامینرژیک بخش متراکم جسم سیاه از دیگر علامت های بیماری پارکینسون وجود یکسری تجمعات سیتوپلاسمی داخل نورونی که به اجسام لوی معروف اند می‌باشد. اجسام لوی اولین بار توسط فردریش لوی در سال 1912 معرفی شدند که به صورت یکسری تجمعات کروی ائوزینوفیلی سیتوپلاسمی متشکل از تعدادی پروتئین مانند آلفا سینوکلئین[8]،  پارکین[9] ، یوبی کوئیتین[10] ، سین فیلین[11] و نوروفیلامنت[12] می‌باشند. ضخامت اجسام لوی حدوداً 15 میکرومتر است و در نواحی مغزی متاثر می‌گردند(5).

اجسام لوی علاوه بر بیماری پارکینسون در سایر بیماری ها مانند آلزایمر و در افراد سالم نیز با افزایش سن دیده می‌شوند. علی رغم وجود اجسام لوی در حالات بیماری ، نقش اجسام لوی در مرگ سلول‌های عصبی نامشخص است و جای بحث دارد. اگر چه این تجمعات پروتئینی به علت  اختلال در فرایند های سلولی طبیعی یا مصادره کردن پروتئین هایی که برای بقای سلولی مهم اند ممکن است  برای نورون ها سمی باشند، احتمال دیگر این است که اجسام لوی ممکن است با به­دام انداختن پروتئین‌های مضرر در تجمعات پروتئینی محافظت کننده باشند(4).

1-2      فاکتورهای دخیل در بیماری پارکینسون:

فاکتور های دخیل در بیماری پارکینسون منجر به اختلال در عملکرد میتوکندریایی، استرس اکسیداتیو و فعال شدن مسیرهای آپوپتوزی می‌گردند که در نهایت باعث تخریب نورون های دوپامینرژیک می‌گردند(6).

این فاکتورها عبارتند از :

1-افزایش سن

2-فاکتورهای محیطی

3-فاکتورهای ژنتیکی

1-2-1     افزایش سن:

در افراد طبیعی با افزایش سن میزان دوپامین و تعداد رسپتور های آن در داخل عقده های قاعده ای به طور دائم کاهش یافته و ظاهراً این تسریع درکاهش موجب بروز بیماری پارکینسون می‌گردد(7).

1-2-2    فاکتور های محیطی:

اگر چه اکثر موارد بیماری پارکینسون غیر ارثی اند اما منشاء آن‌ ها به میزان زیادی نامشخص باقی مانده است. مطالعات اپیدمیولوژیک مشخص کرده است که فاکتور های محیطی در آسیب تخریب کننده عصبی نقش مهمی ایفا می‌کنند.  برای مثال مطالعات اپیدمیولوژیک حاکی از این است که قرار گرفتن در معرض آفت کش ها، فلزات، بی فنیل پرکلرات، برخی حلال ها و برخی مواد ویژه دیگر خطر ابتلا به بیماری پارکینسون را افزایش می‌دهند(8). فاکتورهای محیطی آسیب رسان توسط سه مکانیسم استرس اکسیداتیو ایجاد می‌کنند:

1-القاء تولید ROS[13] 

2- تغییر متابولیسم میتوکندریایی

3- تغییر سیکل اکسیداسیون احیاء(9)

استرس اکسیداتیو  توسط عدم تعادل بین تولید گونه­ های واکنش پذیر اکسیژن و توانایی غیرسمی کردن متابولیت های فعال تولید شده و ترمیم آسیب­های ایجاد شده مشخص می‌گردد. گونه­ های واکنش پذیر اکسیژن یاROS شامل رادیکال‌های آزاد مشتق از اکسیژن (مولکول‌های دارای یک یا تعداد بیشتری الکترون جفت نشده در خارجی ترین لایه والانسی) مانند آنیون سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل و همچنین مشتقات غیر رادیکالی اکسیژن مانند هیدروژن پراکسید می‌باشند(10).

منابع تولید ROS  متعددی داخل سلول وجود دارند. یکی از  تولید کننده‌های  اصلی ROS خانواده ای از آنزیم‌های متصل به غشاء که جهت فعالیت­شان متکی به NADPH[14] می‌باشند. منبع دیگر تولید اکسید کننده‌های داخل سلولی میتوکندری می‌باشد، شواهد زیادی وجود دارند که پیشنهاد می‌کنند اکسید کننده‌های میتوکندریایی غالباً در کمپلکس I وIII زنجیره تنفسی میتوکندری شکل می­گیرند. علاوه بر میتوکندری و NADPH اکسیداز منابع دیگر تولید ROS داخل سلولی نیز، موجودند مانند گروهی از آنزیم‌های داخل سلولی شامل گزانتین­اکسیداز[15]، سیکلواکسیژناز[16]، آنزیم سیتوکروم 450P و لیپواکسیژناز[17]که به عنوان بخشی از فعالیت آنزیمی طبیعی­شان اکسیدکننده­ها را نیز تولید می‌کنند(11).

آنیون سوپر اکسید تولید شده توسط این اکسیدکننده­ها با نیتریک اکسید حاصل از فعالیت نیتریک اکسید سنتاز منجر به شکل گیری طیف وسیعی از اکسیدکننده­ها و نیترات­کننده­ها مانند پراکسی نیتریت می‌گردند. آنیون سوپر اکسید همچنین به کمک سوپر اکسید دسموتاز توسط فعالیت آنزیمی یا غیر آنزیمی تبدیل به هیدروژن پراکسید می‌گردد. هیدروژن پراکسید همچنین می‌تواند توسط میلو پراکسیداز (MPO[18]) هیپوکلروس­اسید و سایر اکسیدکننده‌های مضر مشتق از کلر را تولید کند. بعلاوه از طریق واکنش فنتون[19] تبدیل به یون هیدروکسیل گردد.

بنابراین شکل گیری یک گونه واکنش پذیر می‌تواند نهایتاً منجر به تقویت یک زنجیره تولید کننده از سایر گونه های واکنش پذیر سمی گردد(10).

سلول ها دارای مکانیسم‌های آنتی اکسیدانی ذاتی اند که ROS تولید شده تحت هر دو شرایط فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی را سمیت زدایی می‌کنند.گلوتاتیون احیاء شده[20](GSH) مهمترین مولکول آنتی اکسیدان سلول است و به علت غلظت سیتوزولی بالایش می‌تواند مستقیماً ROS هایی مانند آنیون سوپراکسید، هیدروکسیل و نیتریک اکسید را از سلول بزداید. هیدروژن پراکسید توسط کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز (GPX) به آب احیاء می‌گردد. سیستم گلوتاتیون ردوکتاز[21](GR) و تیوردوکسین ردوکتاز[22](TRX)، گلوتاتیون و تیورودوکسین اکسید شده را با مصرف NADPH دوباره احیاء می‌کنند. سایر مولکول‌های آنتی اکسیدان مانند آسکوربات  یا ویتامین E و آنزیم هایی مانند پراکسی ردوکسین در برابر استرس اکسیداتیو حمایت های مهمی محسوب می‌گردند(12).

پراکسیداسیون لیپید ها اشاره به تخریب اکسید کننده لیپید ها دارد که طی آن به واسطه گرفتن اتم هیدروژن از اسیدهای چرب غیر اشباع آب و یک رادیکال اسید چرب تولید می‌گردد، رادیکال‌های اسید چرب آزاد نیز با آب واکنش داده و رادیکال‌های لیپید پراکسیل تولید می‌گردد که نهایتاً با سایر رادیکال‌های اسید چرب آزاد واکنش داده و باعث افزایش آسیب می‌گردد.

تغییرات اکسیداتیو پروتئین‌ها طیف وسیعی از فعالیت های کینازی، فسفاتازی، پروتئازی، چاپرون ها و فاکتورهای رونویسی را تحت تاثیر قرار می‌دهد. اسید های آمینه مانند سیستئین، متیونین، تریپتوفان و تیروزین در برابر تغییرات اکسید کننده بسیار حساس اند(13).

1-2-2-1   آفت­کش ها و بیماری پارکینسون:

آفت­کش ها تنها روی گونه هدفشان موثر نیستند بلکه اثراتی روی سایر گونه های غیر هدف مانند انسان نیز دارند. سمیت آفت کش ها به وضوح مشخص شده است که طیف وسیعی از فعالیت های فیزیولوژیکی را تغییر می‌دهند، بعلاوه شواهد موجود بیان می‌کنند که قرار گرفتن در معرض آفت کش ها همچنین خطر ابتلا به سرطان و بیماری‌های تخریب کننده عصبی را افزایش می‌دهند(14).